Contenidos

Redes sociales




Espectrometría de resonancia magnética nuclear


La espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN), más comúnmente conocida como espectrometría RMN, es una técnica que explota las propiedades magnéticas de ciertos núcleos. Las aplicaciones más importantes para su uso en química orgánica son la espectrometría RMN de protones y la de carbono-13. En principio, la RMN es aplicable a cualquier núcleo que posea espín.

Pueden obtenerse muchos tipos de información mediante un espectro RMN. Al igual que se utiliza la espectrometría de infrarrojos para identificar grupos funcionales, el análisis de un espectro RMN unidimensional proporciona información sobre el número y tipo de entidades químicas en una molécula.

El impacto de la espectrometría RMN en las ciencias naturales ha sido sustancial. Puede utilizarse, entre otras cosas, para estudiar mezclas de analitos, para comprender efectos dinámicos como el cambio en la temperatura y los mecanismos de reacción, y es una herramienta de valor incalculable para la comprensión de la estructura y función de las proteínas y los ácidos nucleicos. Este tipo de espectrometría se puede aplicar a una amplia variedad de muestras, tanto en solución como en estado sólido.

TÉCNICAS BÁSICAS DE ESPECTROMETRÍA RMN


Cuando se sitúan dentro de un campo magnético, los núcleos activos de RMN (como el 1 H, o el 13 C) absorben a una frecuencia característica del isótopo. La frecuencia de resonancia, la energía de la absorción y la intensidad de la señal son proporcionales a la fuerza del campo magnético. Por ejemplo, en un campo magnético de 21 Tesla, los protones resuenan a 900 MHz. Es común referirse a un imán de 21 T como imán de 900 MHz, aunque distintos núcleos resuenan a una frecuencia diferente en este campo.

En el campo magnético terrestre, los mismos núcleos resuenan en frecuencias de audio. Este efecto se utiliza en los espectrómetros RMN y otros instrumentos. Debido a que estos instrumentos son fáciles de transportar y baratos, a menudo se utilizan para la enseñanza y el trabajo de campo.

Desplazamiento químico


Dependiendo del entorno químico local, los diferentes protones en una molécula resuenan a frecuencias ligeramente diferentes. Dado que tanto este desplazamiento como la frecuencia de resonancia fundamental son directamente proporcionales a la fuerza del campo magnético, el desplazamiento de frecuencia se convierte en un campo independiente de valor adimensional conocido como desplazamiento químico. El desplazamiento químico se reporta como una medida relativa de algunas frecuencias de resonancia de referencia. (Para los núcleos 1 H, 13 C, y 29 Si, se usa como referencia el tetrametilsilano o TMS.) Esta diferencia entre la frecuencia de la señal y la frecuencia de la referencia se divide por la frecuencia de la señal de referencia para obtener el desplazamiento químico. Los desplazamientos de frecuencia son muy pequeños en comparación con la frecuencia RMN fundamental. Un desplazamiento de frecuencia típico podría ser de 100 Hz, en comparación con una frecuencia RMN fundamental de 100 MHz, por lo que el desplazamiento químico se expresa generalmente en partes por millón (ppm).

Mediante la comprensión de los diferentes entornos químicos, el desplazamiento químico puede ser utilizado para obtener información estructural sobre la molécula en una muestra. La conversión de los datos en bruto a esta información se llama asignación del espectro. Por ejemplo, para el espectro 1H-RMN del etanol (CH3CH2OH), cabría esperar tres señales específicas en tres desplazamientos químicos específicos: uno para los grupos CH3, uno para el grupo CH2 y otro para el grupo OH. Un grupo CH3 típico tiene un desplazamiento de alrededor de 1 ppm, un CH2 adjunto a un OH tiene un desplazamiento de alrededor de 4 ppm y un OH tiene un desplazamiento en torno a 2-3 ppm, dependiendo del disolvente utilizado.

A causa del movimiento molecular a temperatura ambiente, los tres protones metilo alcanzan un promedio durante el curso del experimento RMN (que normalmente requiere unos pocos milisegundos). Estos protones se degeneran y forman un pico al mismo desplazamiento químico.

La forma y el tamaño de los picos son indicadores de la estructura química. En el ejemplo anterior -el espectro de protones de etanol-, el pico de CH3 sería tres veces más grande que el OH. Del mismo modo, el pico de CH2 sería el doble en tamaño al pico de OH, pero sólo 2/3 del tamaño del pico de CH3.

El software de análisis moderno permite analizar el tamaño de los picos para comprender cómo muchos protones dan lugar al pico. Esto se conoce como integración, un proceso matemático que calcula el área bajo un gráfico (lo que, en esencia, es un espectro). El analista debe integrar el pico y no medir su altura, porque los picos también tienen anchura y, por ende, su tamaño depende de su área y no de su altura. Sin embargo, cabe mencionar que el número de protones, o cualquier otro núcleo observado, es sólo proporcional a la intensidad, o integral, de la señal RMN, en los experimentos RMN unidimensionales más simples. En experimentos más elaborados, como los que suelen utilizarse para obtener el espectro RMN del carbono-13, la integral de las señales depende de la tasa de relajación del núcleo, y de sus constantes de acoplamiento escalar y dipolar. Muy a menudo, estos factores son poco conocidos, por lo que la integral de la señal RMN es muy difícil de interpretar en los experimentos más complicados.

Acoplamiento-J


Parte de la información más útil para determinar la estructura en un espectro RMN unidimensional proviene del acomplamiento-J o acoplamiento escalar (un caso especial de acoplamiento espín-espín) entre los núcleos activos de RMN. Este acoplamiento surge de la interacción de los diferentes estados espín a traves de los enlaces químicos de una molécula, y resulta en la división de señales RMN. Estos patrones de división pueden ser complejos o simples y, del mismo modo, pueden ser interpretables o engañosos. Este acoplamiento proporciona información detallada sobre la conectividad de los átomos en una molécula.

El acoplamiento a núcleos equivalentes n (espín ½) divide la señal en un multiplete n + 1 con ratios de intensidad que siguen el triángulo de Pascal. El acoplamiento a espines adicionales conducirá a nuevas divisiones de cada uno de los componentes del multiplete; por ejemplo, el acoplamiento a dos núcleos diferentes de espín ½ , con constantes de acoplamiento muy distintas, conducirá a un doblete de dobletes (abreviatura: dd). Hay que tener en cuenta que el acoplamiento entre núcleos que son químicamente equivalentes (es decir, que tienen el mismo desplazamiento químico) no tiene efecto de los espectros RMN, y los acoplamientos entre núcleos que son distantes (por lo general más de 3 enlaces en moléculas flexibles) suelen ser demasiado pequeños para observar divisiones. Los acoplamientos de largo alcance, de más de tres enlaces, se observan a menudo en compuestos aromáticos y cíclicos, conduciendo a patrones de división más complejos.

Por ejemplo, en el espectro de protones para el etanol que se ha descrito anteriormente, el grupo CH3 se divide en un triplete con una relación de intensidad de 1:2:1 mediante los dos protones CH2 vecinos. Del mismo modo, el CH2 se divide en un cuarteto con una relación de intensidad de 1:3:3:1 mediante los tres protones CH3 vecinos. En principio, los dos protones CH2 también se dividen de nuevo en un doblete para formar un doblete de cuartetos mediante el protón hidroxilo, pero el intercambio intermolecular del protón hidroxilo acídico a menudo resulta en una pérdida de información del acoplamiento.

El acoplamiento a cualquier núcleo de espín ½, tal como el fósforo-31 o el flúor-19, funciona de esta manera (aunque las magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy diferentes). Pero los patrones de división difieren de los descritos anteriormente para los núcleos con espín superior a ½ debido a que el número cuántico de espín tiene más de dos valores posibles. Por ejemplo, para el acoplamiento al deuterio (un núcleo de espín 1) divide la señal en un triplete 1:1:1, porque el espín 1 tiene tres estados de espín. Del mismo modo, un núcleo de espín 3/2 divide una señal 1:1:1:1 en un cuarteto y así sucesivamente.

El acoplamiento combinado con el desplazamiento químico (y la integración de protones) nos dice no sólo el entorno químico de los núcleos, sino también el número de núcleos activos RMN vecinos en la molécula. En los espectros más complejos, con múltiples picos en desplazamientos químicos similares, o en el espectro de núcleos distintos del hidrógeno, el acoplamiento es a menudo la única manera de distinguir núcleos diferentes.

Acoplamiento de segundo orden (o fuerte)


La descripción anterior asume que la constante de acoplamiento es pequeña en comparación con la diferencia en frecuencias RMN entre los espines inequivalentes. Si la separación del desplazamiento disminuye (o la fuerza del acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad del multiplete se distorsionan, y luego se vuelven más complejos y difíciles de analizar (especialmente si más de dos espines están involucrados). La intensificación de algunos picos en un multiplete se logra a expensas del resto, que a veces casi desaparece en el ruido de fondo, aunque el área integrada bajo los picos se mantenga constante. En la mayoría de RMN de alto campo, sin embargo, las distorsiones suelen ser modestas y las distorsiones características (techo) pueden ayudar a identificar los picos.

Los efectos de segundo orden disminuyen cuando la diferencia de frecuencia entre multipletes aumenta, por lo que el espectro RMN de alto campo (es decir, de alta frecuencia) muestra menos distorsión que los espectros de frecuencia menor. Los primeros espectros a 60 MHz eran más propensos a la distorsión que los espectros de máquinas posteriores que operan en frecuencias de 200 MHz o superiores.

Inequivalencia magnética


Pueden ocurrir efectos más sutiles si los espines químicamente equivalentes (es decir, núcleos relacionados por simetría y con la misma frecuencia RMN) tienen diferentes relaciones de acoplamiento respecto a los espines externos. Los espines que son químicamente equivalentes pero no son indistinguibles (sobre la base de sus relaciones de acoplamiento) se denominan espines con inequivalencia magnética. Por ejemplo, los sitios 4 H del 1,2-diclorobenceno se dividen en dos pares químicamente equivalentes por simetría, pero un individuo miembro de uno de los pares tiene diferentes acoplamientos a los espines que componen el otro par. La inequivalencia magnética puede dar lugar a espectros muy complejos que sólo pueden ser analizados mediante modelado computacional. Estos efectos son más comunes en los espectros RMN de sistemas aromáticos y otros no flexibles, mientras que el promedio conformacional de los enlaces CC en moléculas flexibles tiende a igualar los acoplamientos entre protones en carbonos adyacentes, reduciendo los problemas con la inequivalencia magnética.

ESPECTROMETRÍA DE CORRELACIÓN


La espectrometría de correlación es uno de los diversos tipos de espectrometría de resonancia magnética nuclear (RMN) bidimensional. Este tipo de experimento RMN es mejor conocido por su acrónimo, COSY. Otros tipos de espectrometría RMN bidimensional son la espectrometría-J, la de intercambio (EXSY), la de efecto Overhauser nuclear (NOESY), la de correlación total (TOCSY), y experimentos de correlación heteronuclear como el HSQC, HMQC y HMBC. Los espectros bidimensionales RMN proporcionan más información acerca de una molécula que los espectros RMN unidimensionales, y son especialmente útiles para determinar la estructura de la molécula, en particular para moléculas que son demasiado complicadas para la RMN unidimensional. El primer experimento bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener, un profesor de la Université Libre de Bruxelles, en 1971. Este experimento fue posteriormente implementado por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst, que publicaron sus trabajos en 1976.

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE ESTADO SÓLIDO


Una variedad de circunstancias físicas impide que las moléculas sean estudiadas en solución, ni tampoco mediante otras técnicas espectroscópicas a un nivel atómico. En los medios de fase sólida, tales como cristales, polvos microcristalinos, geles, soluciones anisotrópicas, etc, se da en particular el acoplamiento dipolar y la anisotropía de desplazamiento químico, que se convierten en dominantes para el comportamiento de los sistemas de espín nuclear. En la espectrometría RMN convencional en estado de solución, estas interacciones adicionales darían lugar a una ampliación considerable de las líneas espectrales. Diversas técnicas permiten establecer condiciones de alta resolución, que pueden, al menos para los espectros de 13 C, ser comparables a los espectros RMN en estado de solución.

Dos conceptos importantes para la alta resolución en la espectrometría RMN de estado sólido son la limitación de la posible orientación molecular mediante orientación de la muestra, y la reducción de las interacciones magnéticas nucleares anisotrópicas mediante giro de la muestra. De este último enfoque, destaca el método del giro rápido en torno al ángulo mágico, cuando el sistema está compuesto por núcleos de espines 1/2. Una serie de técnicas intermedias, con muestras de alineamiento parcial o movilidad reducida, se están utilizando también en espectrometría RMN.

Las aplicaciones de la RMN de estado sólido suelen utilizarse en investigaciones sobre proteínas de la membrana, fibrillas de proteínas, todo tipo de polímeros, análisis en química inorgánica, y también otras más "exóticas" como las hojas de plantas y las pilas de combustible.

ESPECTROMETRÍA RMN APLICADA A PROTEÍNAS


Gran parte de la reciente innovación dentro de la espectrometría RMN se ha dado en el campo de estudio de las proteínas, y se ha convertido en una técnica muy importante en la biología estructural. Un objetivo común de estas investigaciones es obtener una alta resolución de las estructuras tridimensionales de las proteínas, similar a lo que puede lograrse por cristalografía de rayos X. En contraste con la cristalografía de rayos X, la RMN se limita sobre todo a las proteínas relativamente pequeñas, de menos de 35 kDa, aunque los avances técnicos permiten la resolución de estructuras más grandes. La espectrometría RMN es a menudo la única manera de obtener información de alta resolución, en todo o en parte, de proteínas no estructuradas.

Las proteínas son varios órdenes de magnitud más grandes que las pequeñas moléculas orgánicas que se mencionaron anteriormente en este artículo, pero la misma teoría se aplica a la RMN. Debido al mayor número de elementos presentes en la molécula, los espectros unidimensionales básicos se ven solapados con la superposición de señales, hasta el punto de que el análisis resulta imposible. Por lo tanto, se realizan experimentos multidimensionales (2, 3 o 4D) para hacer frente a este problema. Para facilitar estos experimentos, es conveniente marcar isotópicamente la proteína con 13 C y 15 N, debido a que los isótopos 12 C predominantes de forma natural no son activos a la RMN, mientras que el momento cuadrápolo nuclear del isótopo 14 N predominante de forma natural impide que se pueda obtener información de alta resolución a partir de este isótopo de nitrógeno. El método más importante utilizado para la determinación de la estructura de las proteínas utiliza experimentos NOE para medir las distancias entre pares de átomos dentro de la molécula. Posteriormente, las distancias obtenidas se utilizan para generar una estructura 3D de la molécula usando un programa de ordenador.