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Espectrometría de fluorescencia


La espectrometría de fluorescencia (también llamada fluorometría o espectrofluorimetría) es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Una técnica complementaria es la espectrometría de absorción.

Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluorómetros o fluorímetros.

TEORÍA DE LA FLUORESCENCIA


Las moléculas tienen diferentes estados llamados niveles de energía. La espectrometría de fluorescencia se refiere principalmente a estados vibracionales y electrónicos. En general, las especies objeto de examen tendrán un estado electrónico basal (un estado de baja energía) de interés, y un estado electrónico excitado de mayor energía. Dentro de cada uno de estos estados electrónicos hay diferentes estados vibracionales.

En la espectroscopia de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorción de un fotón de luz, desde su estado electrónico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrónico excitado. Las colisiones con otras moléculas causan que la molécula excitada pierda energía vibracional hasta que alcanza el estado vibracional más bajo del estado electrónico excitado.

La molécula desciende luego a uno de los distintos niveles de vibración del estado electrónico basal, emitiendo un fotón en el proceso. Como las moléculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibración en el estado basal, los fotones emitidos tendrán diferentes energías y, por lo tanto, frecuencias. Así pues, mediante el análisis de las diferentes frecuencias de luz emitida por espectrometría de fluorescencia, junto con sus intensidades relativas, se puede determinar la estructura de los diferentes niveles de vibración.

En un experimento típico, se miden las diferentes frecuencias de luz fluorescente emitida por una muestra, manteniendo la luz de excitación a una longitud de onda constante. A esto se le llama espectro de emisión. Un espectro de excitación se mide mediante el registro de una serie de espectros de emisión utilizando luz de diferentes longitudes de onda.

INSTRUMENTOS


En la espectrometría de fluorescencia se utilizan dos tipos generales de instrumentos:

* Fluorómetros de filtro. Utilizan filtros para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.
* Espectrofluorómetros. Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz fluorescente.

Ambos tipos de instrumentos utilizan el siguiente esquema. La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra producen una fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90° con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida llegue al detector.

Diversas fuentes de luz pueden ser utilizadas como fuentes de excitación, incluyendo el láser, fotodiodos y lámparas; arcos de xenón y lámparas de vapor de mercurio. Un láser sólo emite luz de alta irradiancia en un intervalo muy estrecho de longitudes de onda, por lo general a 0,01 nm, lo que hace innecesario el monocromador de excitación o el filtro. La desventaja de este método es que la longitud de onda de un láser no se puede cambiar mucho. Una lámpara de vapor de mercurio es una lámpara lineal, lo que significa que emite luz cerca del pico de longitudes de onda. Por el contrario, un arco de xenón tiene un espectro de emisión continuo con intensidad casi constante en el rango de 300-800 nm, y una irradiancia suficiente para las mediciones hasta justo por encima de 200 nm.

En los fluorímetros pueden usarse filtros y/o monocromadores. Un monocromador transmite luz de una longitud de onda y tolerancia ajustables. El tipo más común de monocromador utiliza un retículo de difracción; es decir, la luz colimada entra en una rejilla y sale con un ángulo diferente dependiendo de la longitud de onda. El monocromador puede entonces seleccionar qué longitudes de onda transmite. Para permitir mediciones de anisotropía se añaden dos filtros de polarización: uno después del monocromador de excitación o filtro, y otro antes del monocromador de emisión o filtro.

Como se mencionó antes, la fluorescencia se mide más a menudo en un ángulo de 90° en relación a la luz de excitación. Esta geometría se utiliza en lugar de colocar el sensor en la línea de la luz de excitación en un ángulo de 180° a fin de evitar la interferencia de la luz de excitación transmitida. El monocromador no es perfecto y transmitirá la luz con otras longitudes de onda diferentes a las establecidas. Un monocromador ideal sólo transmite luz en el rango especificado y tiene una transmisión independiente de la longitud de onda. Al medir en un ángulo de 90º, sólo la luz dispersa por la muestra provoca luz. Esto se traduce en una mejor relación señal-ruido, y reduce el límite de detección a un factor de aproximadamente 10000, si se compara con la geometría de 180°. Por otra parte, la fluorescencia también puede ser medida desde la parte delantera, procedimiento que se utiliza a menudo para las muestras turbias.

El detector puede ser de un solo canal o de múltiples canales. El detector de un único canal sólo puede detectar la intensidad de una longitud de onda en cada momento, mientras que el de múltiples canales detecta la intensidad en todas las longitudes de onda simultáneamente, con lo que el monocromador de emisión o filtro es innecesario. Los diferentes tipos de detectores tienen sus ventajas y desventajas.

El fluorímetro más versátil, con monocromadores dobles y una fuente de luz de excitación continua, puede registrar tanto un espectro de excitación como un espectro de fluorescencia. Al medir los espectros de fluorescencia, la longitud de onda de la luz de excitación se mantiene constante, de preferencia en una longitud de onda de alta absorción, y el monocromador de emisión escanea el espectro. Para medir los espectros de excitación, la longitud de onda que pasa a través del filtro o monocromador de emisión se mantiene constante y el monocromador de excitación va escaneando. El espectro de excitación generalmente es idéntico al espectro de absorción, ya que la intensidad de la fluorescencia es proporcional a la absorción.

ANÁLISIS DE LOS DATOS


A bajas concentraciones, la intensidad de fluorescencia es, por lo general, proporcional a la concentración del fluoróforo.

A diferencia de la espectrometría visible o ultravioleta 'estándar', los espectros independientes del dispositivo no son fáciles de alcanzar. Son varios los factores que influyen y distorsionan los espectros, y son necesarias correcciones para lograr el espectro 'verdadero', es decir, independiente de la máquina.

Los distintos tipos de distorsiones se pueden clasificar en relación al instrumento o a la muestra. En primer lugar, veamos las distorsiones derivadas del instrumento. Como punto de partida, la intensidad de las fuentes de luz y las características de la longitud de onda varían con el tiempo durante cada experimento. Por otra parte, ninguna lámpara tiene una intensidad constante en todas las frecuencias. Para corregir esto, se puede aplicar un haz separador después del filtro o monocromador de excitación, para dirigir una porción de luz a un detector de referencia.

Además, debe tenerse en cuenta el rendimiento de transmisión de los monocromadores y los filtros, ya que también puede cambiar con el tiempo. La eficacia de la transmisión del monocromador varía dependiendo de la longitud de onda. Esta es la razón por la que debe colocarse un detector de referencia después del filtro o monocromador de excitación. El porcentaje de fluorescencia recogido por el detector también depende del sistema. Por otra parte, la eficiencia cuántica del detector, es decir, el porcentaje de fotones detectados, varía entre los diferentes detectores, según la longitud de onda y el tiempo.

La corrección de todos estos factores instrumentales para conseguir un "estándar" del espectro es un proceso tedioso, que sólo se aplica en la práctica cuando es estrictamente necesario. Es el caso de las mediciones de rendimiento cuántico o cuando se encuentra la longitud de onda con la mayor intensidad de emisión, por ejemplo.

Como se mencionó anteriormente, también surgen distorsiones de la muestra. Por lo tanto, algunos aspectos de la muestra deben tenerse en cuenta también. En primer lugar, la fotodescomposición puede disminuir la intensidad de fluorescencia con el tiempo. La dispersión de la luz también debe tenerse en cuenta. Los tipos más importantes de dispersión en este contexto son la dispersión de Rayleigh y la de Raman. La luz dispersa por dispersión de Rayleigh tiene la misma longitud de onda que la luz incidente, mientras que en la dispersión Raman la luz cambia a longitudes de onda más largas. La dispersión de Raman es el resultado de un estado electrónico virtual inducido por la luz de excitación. A partir de este estado virtual, las moléculas pueden volver a un nivel vibracional distinto del estado basal. En los espectros de fluorescencia siempre se observa una diferencia de número de onda constante en relación con la excitación; por ejemplo, en el agua el pico aparece a un número de onda 3600 cm-1 inferior a la luz de excitación.

Otros aspectos a considerar son los efectos del filtro interior. Estos incluyen la reabsorción, que ocurre porque otra molécula o parte de una macromolécula absorbe las longitudes de onda en la que el fluoróforo emite radiación. Si este es el caso, una parte o la totalidad de los fotones emitidos por el fluoróforo pueden ser absorbidos de nuevo. Otro efecto del filtro interno se produce a causa de las altas concentraciones de absorción de las moléculas, incluyendo el fluoróforo. El resultado es que la intensidad de excitación de la luz no es constante a lo largo de la solución. Como resultado, sólo un pequeño porcentaje de la luz de excitación llega a los fluoróforos que son visibles para el sistema de detección. Los efectos del filtro interior cambian el espectro y la intensidad de la luz emitida y, por tanto, deben ser considerados al analizar el espectro de emisión de luz fluorescente.

APLICACIONES


La espectrometría de fluorescencia se utiliza en análisis bioquímicos, médicos, químicos y de investigación de compuestos orgánicos. También se ha utilizado para diferenciar los tumores malignos de piel de los benignos.

La fluorescencia también puede utilizarse para reorientar los fotones.

Fluorescencia del triptófano


Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede ser usada para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano (un aminoácido). Cuando se realizan experimentos con desnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas, el microambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, si una proteína que contiene un único triptófano en su núcleo "hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, aparece un cambio de color en el espectro de emisión del rojo. Esto se debe a la exposición del triptófano a un medio ambiente acuoso en contraposición a una proteína hidrofóbica interior. En contraste, la adición de un tensioactivo a una proteína que contiene triptófano, que se encuentra expuesto al solvente acuoso, causará un cambio al espectro azul de emisión si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela de surfactante. Las proteínas que carecen de triptófano puede ser enlazadas a un fluoróforo.

A 295 nm, el espectro de emisión del triptófano es dominante sobre la fluorescencia más débil de la tirosina y fenilalanina.