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Espectrometría Raman


La espectrometría Raman es una técnica espectroscópica utilizada en física de la materia condensada y también en química para el estudio de los modos vibracionales, rotacionales y otros de baja frecuencia en un sistema. Se basa en la dispersión inelástica, o dispersión Raman, de la luz monocromática, que por lo general procede de un láser en el rango visible, infrarrojo cercano, o ultravioleta cercano. La luz láser interactúa con fonones u otras excitaciones en el sistema, por lo que la energía de los fotones láser se desplaza hacia arriba o hacia abajo. Normalmente, la muestra se ilumina con un rayo láser. La luz del punto iluminado se recoge con una lente y se envía a través de un monocromador.

Las longitudes de onda cercanas a la línea láser, debidas a la dispersión elástica de Rayleigh, son filtradas, mientras que el resto de la luz recogida se dispersa en un detector.

La dispersión Raman espontánea es generalmente muy débil y, como resultado, la principal dificultad de la espectrometría Raman es separar la luz débil dispersada inelásticamente de la luz intensa láser por dispersión de Rayleigh. Históricamente, los espectrómetros Raman utilizaban rejillas de difracción holográfica y múltiples etapas de dispersión para lograr un alto grado de rechazo láser. En el pasado, los detectores de elección para las configuraciones de dispersión Raman eran los fotomultiplicadores, lo que daba lugar a largos tiempos de adquisición. Sin embargo, la instrumentación moderna en casi todo el mundo emplea filtros de muesca o borde para rechazar el láser, así como espectrógrafos y detectores CCD.

Hay diferentes tipos avanzados de espectrometría Raman, como la de superficie potenciada, la polarizada, la estimulada, la de transmisión, la compensada espacialmente y la híper-Raman.

TEORÍA BÁSICA


El efecto Raman se produce cuando la luz incide sobre una molécula e interactúa con la nube de electrones de los átomos de esa molécula. El fotón incidente excita uno de los electrones a un estado virtual. La molécula se excita desde el estado basal a un estado de energía virtual, y se relaja a un estado vibracional excitado, lo que genera la dispersión de Raman Stokes. Si la molécula ya se encontraba en un estado elevado de energía vibracional, la dispersión Raman se llama entonces dispersión Raman anti-Stokes.

Para que la molécula exhiba el efecto Raman es necesario un desplazamiento en la polarizabilidad molecular, o cantidad de deformación de la nube de electrones con respecto a la coordenada vibracional. La cantidad del desplazamiento de polarizabilidad determinará la intensidad de la dispersión Raman, siempre que el desplazamiento Raman sea igual al nivel vibracional que está involucrado.

HISTORIA




Aunque la dispersión inelástica de la luz la predijo Smekal en 1923, no fue hasta 1928 cuando se observó en la práctica. El efecto Raman fue nombrado después de que uno de sus descubridores, el científico indio Sir CV Raman, observara el efecto por medio de la luz del sol (en 1928, junto con KS Krishnan e independientemente de Grigory Landsberg y Leonid Mandelstam). Raman ganó el Premio Nobel de Física en 1930 por este descubrimiento, realizado utilizando la luz del sol, un filtro fotográfico de banda estrecha para crear luz monocromática y un filtro "cruzado" para bloquear esta luz monocromática.

Posteriormente, el arco de mercurio se convirtió en la principal fuente de luz, primero con detección fotográfica y, a continuación, con detección espectrofotométrica. En la actualidad, se utilizan láseres como fuentes de luz.

APLICACIONES


La espectrometría Raman se utiliza comúnmente en química, ya que la información vibracional es muy específica para los enlaces químicos de las moléculas. Por lo tanto, proporciona una huella dactilar de la molécula que puede ser identificada. La región de huella digital de las moléculas orgánicas está en el rango de 500-2000 cm -1. Otra forma de uso de la técnica es el estudio de cambios en las uniones químicas, por ejemplo cuando un sustrato se añade a una enzima.

Los analizadores de gases Raman tienen muchas aplicaciones prácticas. Por ejemplo, se usan en medicina para el seguimiento en tiempo real de las mezclas de gases respiratorios y la anestesia durante la cirugía.

En física del estado sólido, la espectrometría Raman espontánea se utiliza para, entre otras cosas, caracterizar los materiales, medir la temperatura, y encontrar la orientación cristalográfica de una muestra.

Al igual que ocurre con moléculas individuales, un material sólido tiene modos de fonón característicos que pueden ayudar a identificarlo. Además, la espectrometría Raman se puede utilizar para observar otras excitaciones de baja frecuencia en los sólidos, como plasmones, magnones, y excitaciones de brecha en superconductores.

La señal Raman espontánea proporciona información sobre la población de un modo fonón determinado en el rango entre la intensidad Stokes (desplazada hacia abajo) y anti-Stokes (desplazada hacia arriba).



La dispersión Raman mediante un cristal anisotrópico da información sobre la orientación del cristal. La polarización de la luz de dispersión Raman en relación con el cristal, y la polarización de la luz láser, pueden utilizarse para conocer la orientación del cristal, siempre que la estructura cristalina sea conocida.

Las fibras activas Raman, como la aramida y el carbono, tienen modos vibracionales que muestran un cambio en la frecuencia Raman con estrés aplicado. Las fibras de polipropileno también exhiben cambios similares.

El modo de respiración radial es una técnica de uso habitual para evaluar el diámetro de los nanotubos de carbono.

La espectrometría Raman compensada espacialmente (SORS), que es menos sensible a las capas superficiales que la espectrometría Raman convencional, se puede utilizar para descubrir la falsificación de medicamentos sin necesidad de abrir su embalaje interior, y para monitorización no invasiva de tejido biológico.

La espectrometría Raman se puede utilizar también para investigar la composición química de documentos históricos, como el Libro de Kells, y contribuir al conocimiento de las condiciones sociales y económicas en el momento en que los documentos fueron producidos. Esto es especialmente útil porque la espectrometría Raman es una forma no invasiva que permite preservar este tipo de materiales.

MICROESPECTROMETRÍA RAMAN


La espectrometría Raman ofrece varias ventajas para el análisis microscópico. Dado que se trata de una técnica de dispersión, las muestras no necesitan ser fijadas o seccionadas. Los espectros Raman pueden ser obtenidos a partir de un volumen muy bajo (<1 μm de diámetro); estos espectros permiten la identificación de especies presentes en ese volumen. El agua no interfiere de manera apreciable. Por lo tanto, la espectroscopia Raman es adecuada para el examen microscópico de minerales, materiales como cerámica y polímeros, y células y proteínas. Un microscopio Raman consiste de un microscopio óptico estándar con un láser de excitación, un monocromador y un detector sensible (como un dispositivo de carga acoplada (CCD), o un tubo fotomultiplicador (PMT)).

En visualización directa, todo el campo de visión se examina por dispersión sobre una pequeña gama de números de onda (turnos Raman). Por ejemplo, un número de onda característico para el colesterol podría ser utilizado para registrar la distribución de colesterol en un cultivo celular.



El otro enfoque es la visualización hiperespectral o las imágenes químicas, en las que miles de espectros Raman son adquiridos por todo el campo de visión. Los datos pueden ser utilizados para generar imágenes que muestran la ubicación y la cantidad de distintos componentes. Tomando el ejemplo del cultivo celular, una imagen hiperespectral podría mostrar la distribución de colesterol, así como de proteínas, ácidos nucleicos y ácidos grasos. Las técnicas sofisticadas de procesamiento de imágenes y señales pueden utilizarse para ignorar la presencia de agua, los medios de cultivo y otros interferentes.

La microscopía Raman y, en particular, la microscopía confocal, disponen de una resolución espacial muy alta. Por ejemplo, las resoluciones laterales y de profundidad son de 250 nm y 1,7 μm, respectivamente, utilizando un microespectrómetro confocal Raman con la línea de 632,8 nm de un láser de He-Ne con una abertura de 100 μm de diámetro.

Dado que las lentes objetivo de los microscopios enfocan el rayo láser a varios micrómetros de diámetro, el resultado del flujo de fotones es mucho mayor que los que se logran en las configuraciones Raman convencionales. Esto tiene el beneficio añadido de una mayor desactivación de la fluorescencia. Sin embargo, el alto flujo de fotones también puede causar la degradación de la muestra, y por esta razón algunas configuraciones requieren un sustrato que conduzca térmicamente (lo que actúa como un disipador de calor) a fin de mitigar este proceso.

Mediante el uso de la microespectrometría Raman, se pueden medir los espectros Raman, resueltos en vivo en el tiempo y el espacio, de regiones microscópicas de la muestra. Como resultado de esto, puede eliminarse la fluorescencia del agua, el medio y los intermediarios. En consecuencia, este tipo de espectrometría es apropiada para examinar proteínas, células y órganos.

Para muestras biológicas y médicas, la microscopía Raman generalmente utiliza láseres de infrarrojo cercano (diodos de 785 nm y 1064 nm). Esto reduce el riesgo de dañar la muestra mediante la aplicación de alta potencia. Sin embargo, la intensidad del Raman en infrarrojo cercano es baja (debido a la dependencia ω -4 de la intensidad de dispersión Raman), y la mayoría de detectores requieren mucho tiempo de registro. En la actualidad se dispone de detectores más sensibles, por lo que esta técnica es apropiada para uso general. La microscopía Raman de muestras inorgánicas, tales como rocas, cerámicas y polímeros, puede utilizar una gama más amplia de longitudes de onda de excitación.

ANÁLISIS RAMAN POLARIZADO


La polarización de la luz dispersada Raman también contiene información útil. Esta propiedad puede medirse utilizando un láser de excitación polarizado y un analizador de polarización. Los espectros adquiridos con el analizador, tanto en perpendicular como en paralelo al plano de excitación, pueden ser utilizados para calcular el coeficiente de despolarización. El estudio de la técnica es pedagógicamente útil en la enseñanza de las conexiones entre la teoría de grupos, la simetría, la actividad Raman y los picos en el espectro Raman correspondiente.

La información espectral que se deriva de este análisis da una idea sobre la orientación molecular y la simetría vibracional. En esencia, permite al usuario obtener valiosa información relativa a la forma molecular, por ejemplo, en química sintética o análisis polimórfico. A menudo se utiliza para entender la orientación macromolecular en entratamados cristalinos, cristales líquidos o muestras de polímeros.



VARIACIONES DE LA ESPECTROMETRÍA RAMAN


Se han desarrollado diversas variaciones de la espectrometría Raman. El propósito habitual es aumentar la sensibilidad (por ejemplo, una mayor superficie Raman), para mejorar la resolución espacial (microscopía Raman), o para adquirir información muy específica (resonancia Raman).

* Espectrometría Raman de superficie mejorada (SERS). Normalmente se hace en un coloide de plata o de oro, o en un sustrato que contiene plata u oro. Los plasmones de superficie de plata y oro son excitados por el láser, lo que resulta en un aumento en los campos eléctricos que rodean el metal. Teniendo en cuenta que las intensidades Raman son proporcionales a la intensidad del campo eléctrico, hay un gran aumento de la señal medida (de hasta 10 y 11). Este efecto fue observado por Fleishman, pero prevaleció la explicación propuesta por Van Duyne en 1977.

* Hiper-Raman. Un efecto no lineal en el que los modos vibracionales interactúan con el segundo armónico del haz de excitación. Para ello se requiere una potencia muy alta, pero permite la observación de los modos vibracionales que son normalmente "silenciosos". A menudo se basa en una potenciación de tipo SERS para incrementar la sensibilidad.

* Espectrometría Raman de resonancia. La longitud de onda de excitación es equivalente a una transición electrónica de la molécula o cristal, a fin de que los modos vibracionales asociados con el estado electrónico excitado se vean muy potenciados. Esto es útil para el estudio de moléculas grandes, como los polipéptidos, que pueden mostrar cientos de bandas en los espectros Raman "convencionales". También es útil para asociar los modos normales con sus cambios de frecuencia observados.

* Espectrometría Raman espontánea. Utilizada para estudiar la dependencia a la temperatura de los espectros Raman de las moléculas.

* Espectrometría Raman de pinzas ópticas (OTRS). Se utiliza para estudiar partículas individuales, e incluso procesos bioquímicos en células individuales atrapadas por pinzas ópticas.

* Espectrometría Raman estimulada. Un pulso de dos colores transfiere la población desde el estado basal a un estado excitado rovibracional, si la diferencia de energía se corresponde a una transición Raman permitida. Dos fotones de ionización ultravioleta, aplicados después de la transferencia de población (pero antes de la relajación), permite registrar el espectro Raman intra-molecular o inter-molecular de un gas o grupo molecular. Esta es una técnica útil para observar la dinámica molecular.

* Espectrometría Raman compensada espacialmente (SORS). La dispersión Raman se obtiene de regiones compensadas lateralmente fuera del punto láser de excitación, lo que disminuye significativamente las aportaciones de la capa superficial en comparación con la espectrometría Raman tradicional.

* Espectrometría Raman anti-Stokes coherente (CARS). Se utilizan dos rayos láser para generar un haz de frecuencia anti-Stokes coherente, que puede ser mejorada mediante resonancia.